鱼类肠道微生物研究进展

今天转载了一篇Aquaculture Research的评论文章：Role of gastrointestinal microbiota in fish。文章的引用信息如下：

近年来，肠道微生物研究逐渐成为热点，涉及人类疾病、畜牧兽医、鱼类等各个领域。

其实，早在2010年就有日本学者的综述，系统地论述了鱼类肠道微生物的形成与建立、影响因素、主要成分、功能研究的无菌模型、肠道菌群在免疫中的作用、肠道菌群在营养中的作用、肠道菌群在疾病爆发中的作用、肠道菌群在鱼类健康管理中的作用、鱼类肠道菌群的调控、益生菌和益生元的概念等。

笔者认为该文章值得系统阅读和分析，故与读者分享。

1. 鱼类胃肠道菌群的开发与建立

肠道菌群的定植、建立、组成和多样性是一个复杂的过程，是养殖水体、饲料和环境中微生物的具体体现。在肠道中，最常见的细菌有两类，一类是外来细菌或暂住细菌，另一类是本土细菌或贴壁细菌。

后者往往能耐受较低的pH值，抵抗胆汁酸的破坏，成功定植于胃肠道上皮层，并牢牢附着于肠黏膜上，成为宿主的土著菌群；而前者则因缺乏在肠黏膜或上皮层定植的能力或与其他菌群竞争中处于劣势，而成为短暂的过客。

仔稚鱼时期肠道菌群的定植也是一个非常复杂的过程，与鱼的种类、饲料和环境密切相关。

在仔鱼开始摄食前，肠道菌群丰度很低，一般在102 CFU/尾左右，这是仔鱼从水体中获取以维持渗透压平衡所需的营养物质。但当仔鱼开始摄食后，肠道菌群会迅速回升至105 CFU/尾，说明饵料对肠道菌群的影响巨大。

2. 影响胃肠道菌群建立的因素

一系列外部和内部因素都会影响鱼类肠道菌群的建立和性质。影响初始菌群及其定植的因素包括鱼类的发育阶段、肠道结构、环境因素（如水温）和饲养条件。

此外，应激因素也能显著影响肠道菌群的结构，当特定的化学药物、抗生素、农药等进入水产动物肠道后，会显著影响肠道菌群的组成，造成特定菌群的减少甚至消失。

饲料和饲养条件也会影响鱼的肠道菌群。在幼鱼阶段，肠道菌群随饲料变化较快。Ringo等（1994）研究发现，野生嘉鱼肠道中的肠杆菌科细菌与摄入富含多春鱼子饲料呈正相关，淡水捕捞的嘉鱼以气单胞菌为主，而海水捕捞的嘉鱼以弧菌为主。

此外，Ringo 等人发现，饲喂鱼糜饲料的大西洋鳕鱼的肠道菌群主要为革兰氏阳性菌，包括环毛菌（Cyclotrichia）和肉龙菌（Carnosaurus）等种，而饲喂豆粕饲料的大西洋鳕鱼的肠道菌群主要为嗜冷杆菌（Psychrobacter）、金杆菌（Chryseobacterium）和肉龙菌（Carnosaurus）。

有趣的是，肠道菌群存在季节性甚至日内波动，以罗非鱼为例，夏季肠道菌群数量约为1.6x106至5.1x107 CFU/g淡水鱼的种类，秋季约为3.1x108至1.3x109 CFU/g，冬季约为8.9x105至1.3x107 CFU/g。

从种类上看，养殖斑点叉尾鮰体内的大肠杆菌、克雷伯氏菌、假单胞菌、绿脓杆菌、志贺氏菌、链球菌、莫拉氏菌的含量随季节变化而变化。

3. 鱼胃肠道的微生物组成

与其他动物一样，肠道是微生物最喜欢的生态位，因此鱼类肠道菌群种类极其丰富，但关于鱼类肠道菌群种类的信息往往完全不一致。

早期研究多以可培养技术对肠道内容物或粪便进行均质培养，辅以传统的形态学和生理生化鉴定，但传统方法无疑存在耗时较长、对不可培养菌缺乏敏感性等问题，因此基于可培养技术的肠道菌群研究常常导致不确定的结果。

近年来，随着克隆杂交、脉冲电泳、PCR、DGGE、荧光原位杂交等分子生物学方法的兴起，人们对可培养和不可培养细菌群体进行了大量的工作。

无论是可培养技术还是非培养技术均已证实，细菌是鱼类肠道内的主要微生物，此外，在一些鱼类的肠道中也发现了酵母菌，包括红酵母属的种，这种酵母菌在海水鱼和淡水鱼的肠道中均有存在，还有梅尔酵母、皮斯特酵母和假丝酵母，这些酵母菌只存在于海水鱼的肠道中。

鱼的肠道菌群多为需氧或兼性厌氧、兼性厌氧或专性厌氧菌，主要有鲸类、拟杆菌和梭菌。Currie等研究发现草鱼肠道内厌氧菌与需氧菌数量大致相同，均为107CFU/g。

与温血动物相比，鱼类肠道菌群数量较少，且其数量随年龄、营养、环境等变化较大，其大致数量为需氧菌104～109个/g，厌氧菌6.6x104～1.6x109CFU/g。

淡水鱼与海洋鱼肠道菌群组成存在明显差异，例如在大部分淡水鱼中，气单胞菌属、假单胞菌属和拟杆菌属为主要肠道菌群，其次为肠杆菌科、微球菌属、不动杆菌属、梭状芽孢杆菌属等；而在海洋鱼类中，弧菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、棒状杆菌属、交替单胞菌属、黄杆菌属和微球菌属为主要肠道菌群。

4. 鱼类胃肠道微生物群的作用：无菌方法

无菌模型是在无菌条件下或特定已知细菌条件下培养动物，是研究肠道微生物的推荐模型。各种无菌模型揭示了肠道菌群在营养代谢和吸收、外来化合物代谢、能量平衡调节、上皮细胞更新、竞争性抑制以及粘膜免疫发育和成熟中的作用。

目前鱼类的悉生模型也有报道并用于研究脊椎动物肠道菌群的进化、肠道菌群的调控及其在营养和免疫中的作用。鱼类悉生模型的研究表明，肠道菌群参与上皮细胞的分化和成熟。缺乏肠道菌群的鱼肠上皮刷状缘碱性磷酸酶活性受到影响，肠聚糖的表达也多以未成熟形式存在。

与无菌模型斑马鱼相比，正常斑马鱼的碱性磷酸酶活性（肠道上皮成熟的标志）、黏膜分泌杯状细胞、激素肠内分泌细胞均明显增加；而且肠道菌群能够上调与DNA修复、上皮细胞分化增殖相关的15个基因的表达。

5. 胃肠道菌群在免疫中的作用

肠道免疫系统又称肠相关淋巴组织（GALT），不仅为机体提供免疫防御，还具有免疫调节功能。肠黏膜上皮细胞与免疫因子及菌群之间一系列复杂的相互作用对GALT的发育成熟至关重要，这已被众多无菌模型研究证实。

目前，肠道菌群促进免疫系统发育的机制有多种，如细菌可通过经典的抗原依赖性特异性免疫反应途径促进胃肠道B细胞增殖淡水鱼的种类，或直接激活先天性免疫途径。早期肠道与活菌的接触和定植对肠道免疫屏障的发育非常重要鱼类肠道微生物研究进展鱼类肠道微生物研究进展，因此在幼苗期饲料中添加益生菌可以增加嗜酸性粒细胞亚群的数量。

虽然大多数外源益生菌的作用是暂时的，只能维持一定的时间，停止进食后就会恢复到原来的组成，但其对肠道免疫和全身免疫的增强作用是毋庸置疑的。

6. 胃肠道菌群在营养中的作用

肠道菌群在营养中的作用早已成为人们关注的焦点，肠道菌群能产生维生素、氨基酸、消化酶、各种生长因子及其他代谢产物，主要酶有碳水化合物酶、磷酸酶、酯酶、脂肪酶、肽酶、纤维素酶、蛋白酶等。

例如，高浓度的气单胞菌可能在消化过程中发挥重要作用，因为它们会分泌多种蛋白酶。一些肠道菌群具有降解乙酰葡萄糖胺、几丁质、纤维素和胶原蛋白的能力，从而为鱼类提供营养。

最近的研究证实，厌氧菌可能在鱼类的消化和吸收过程中发挥重要作用。据报道，鲤鱼、鲱鱼、大口鲈鱼等鱼类中都含有挥发性脂肪酸，这是厌氧发酵的最终产物。在维生素生产方面，已证实许多鱼类的肠道菌群能产生维生素 B12，但不同鱼类的肠道菌群存在差异。

例如，罗非鱼肠道菌群产生的维生素B12远高于斑点叉尾鮰，罗非鱼每天每公斤体重可产生11.2纳克的维生素B12，而斑点叉尾鮰每天每公斤体重只能产生1.4纳克的维生素B12，这是因为罗非鱼肠道内的厌氧菌数量多于斑点叉尾鮰。

7. 胃肠道微生物群在疾病爆发中的作用

肠道菌群根据致病性可分为非致病菌、致病菌和共生菌，它们会影响鱼的健康和疾病的爆发。

在健康人体内，有些细菌会在肠道内定植，有些细菌则是暂时性的，肠道菌群和宿主免疫力之间建立了一种平衡，一旦这种平衡被打破，一些具有致病性的暂时性细菌就会诱发感染。

肠道、皮肤和鳃是病原体进入鱼类的主要途径，高密度集约化水产养殖的出现使得疾病爆发非常常见，无论是淡水还是海水养殖，无论是温水鱼还是冷水鱼。

经肠道感染的疾病有弧菌病、疖病、脓毒症、气单胞菌等。通过对溶藻弧菌黏膜系统黏附动力学的研究，表明肠道是大黄鱼溶藻弧菌感染的主要途径。

对太平洋鲑鱼的研究结果证实，其肠道及幽门盲囊内存在大量的鳗弧菌和奥氏弧菌，更为严重的是，这些病原菌会在肠道内黏附或定植，释放一系列的酶或毒素，破坏肠道的完整性，在数小时内引起感染和发病。

8. 胃肠道微生物群在鱼类健康管理中的作用

在很长一段时间里，人们认为肠道菌群的活力与宿主的寿命密切相关。在陆生动物中，肠道菌群不仅协助消化功能，而且是抵御病原体的保护屏障。肠道微生物与入侵的病原体竞争营养，还会分泌一些抗菌物质来保护宿主。

Sugita等发现淡水鱼中约有2.7%的肠道微生物能抑制各种致病菌，约有3.2%的肠道微生物能抑制气单胞菌，在海水鱼中，这个比例比较高，例如Westerdahl等报道大比目鱼的肠道菌群中约有28%的肠道微生物能抑制李斯特菌。

对半滑舌鱼的研究结果表明，当鱼苗开始采食时，其肠道内竞争性微生物数量会明显增加，6周后，约40%的肠道微生物能够竞争性抑制李斯特菌和光小杆线虫。

更有趣的是，很多细菌都有广谱的抑制活性，比如鲑鱼、鳟鱼肠道中常见的肉食性细菌，可以抑制嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、黄杆菌、发光细菌、鳗弧菌、链球菌等。

9. 鱼类胃肠道微生物群的调控

近年来，利用饲料添加剂调节鱼类肠道菌群组成和活性，从而改善宿主整体健康状况的研究日益受到重视。主要方法包括添加有益微生物（益生菌）或能选择性促进特定肠道微生物增殖而不能被消化的物质（益生元），或两者结合使用（合生元）。

10. 益生菌概念

益生菌是有益的微生物，可以改善宿主的整体健康状况。无论是本土的还是外来的，益生菌在水产养殖中的使用已经非常普遍。常用的种类包括酵母、梭菌、芽孢杆菌、肠球菌、乳酸杆菌、希瓦氏菌、明串珠菌、乳球菌、肉菌、气单胞菌等。

使用方法包括加入饲料或喷洒，加入饲料是建立并成功定植肠道菌群的较好方法，而加入水中也可达到多重效果。

例如在斑点叉尾鮰养殖水体中添加芽孢杆菌，可提高成活率和产量；在罗非鱼养殖池中添加芽孢杆菌和红假单胞菌，可促进生长，提高免疫力；在虹鳟鱼养殖池中添加假单胞菌，可抵抗鳗弧菌的感染。

11. 益生元概念

益生元通常是难消化的寡糖，可以添加到饲料中，以促进肠道中特定有益微生物的增殖。益生元往往能促进宿主肠道中乳酸菌和双歧杆菌的增殖。

常用的益生元有低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、低聚木糖、菊粉、乳果糖和低聚乳糖等。现有的报道显示，添加益生元可以促进鲤鱼、虹鳟鱼等鱼类的生长，提高免疫力和抗病能力，其作用机制包括增加宿主的消化酶、增厚肠黏膜等。

但使用益生元必须考虑两个问题，一是多种病原菌或条件致病菌均可利用多种碳水化合物，造成大量繁殖，不但益生元的效果无法体现，还有诱发疾病的潜在风险；二是部分益生元在高浓度使用时会产生副作用，如高浓度的菊粉会损伤肠道上皮细胞。

益生菌和益生元的概念催生了合生元的概念，即两者结合产生同步效应，会达到更好的效果。例如球菌与低聚甘露糖的组合比单独使用效果更好，可以显著提高虹鳟的免疫力和对鳗弧菌的抵抗力。芽孢杆菌与低聚麦芽糖的组合可以显著提高虾的免疫力和对特定病原体的抵抗力。